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            發布論文

            熒光原位雜交技術檢測CLL分子遺傳學異常

              2020-10-17    11  上傳者:管理員

            摘要:目的:探討熒光原位雜交技術在慢性淋巴細胞白血病(CLL)診斷和預后評估中的價值。方法:采用RB1(13q14.1)、D13S25(13q14.3)、p53(17p13.1)、ATM(11q22.3)及CSP125組探針對93例初診CLL患者進行檢測,同期進行常規染色體核型分析。分析FISH檢測出的遺傳學異常與患者的臨床Binet分期、Rai分期及其他檢測指標的相關性。結果:93例初診CLL患者分子遺傳學異常檢出率為79.6%(74/93),其中13q缺失(13q-)陽性率最高,占45.2%;其次為12號染色體三體(+12)占26.9%、p53缺失(17p-)占19.4%、ATM缺失(11p-)占17.2%。同時伴有2種及2種以上染色體異常患者27例(29.0%),其中13q-伴17p-者8例,13q-伴11q-者5例,13q-伴+12者4例。CC檢測結果相比較,FISH檢測結果中患者的陽性率非常顯著高于CC檢測結果(χ2=32.127,P<0.01)。FISH檢測結果與Rai分期沒有顯著相關性(P>0.05),伴17p-的CLL患者Binet分期更晚(P=0.012)。各分子遺傳學異常與患者年齡、外周血淋巴細胞計數絕對值和CD38表達水平之間均無顯著相關性(P>0.05)。女性患者13q-的發生率(65.4%)顯著高于男性患者(37.3%)(P=0.015);17p-患者IGHV未突變(U-IGHV)的比例顯著高于17p-陰性患者(P=0.013);29.0%的患者表達CD38,且與臨床分期及U-IGHV呈顯著相關(P值分別為0.027及0.006)。結論:FISH技術能夠大大地提高CLL患者分子遺傳學異常的檢出率,是常規細胞遺傳學有力的補充,對CLL患者的臨床分期及預后判斷均有重要的應用價值。

            • 關鍵詞:
            • 臨床分期
            • 慢性淋巴細胞白血病
            • 染色體核型分析
            • 熒光原位雜交
            • 血液科
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            慢性淋巴細胞白血病是一種B淋巴細胞克隆性增殖疾病,不同患者預后差別很大,細胞及分子遺傳學異常是影響CLL進展和患者預后的重要因素。慢性淋巴細胞白血病染色體異常改變較多,其中以13號染色體(D13S25和RB1基因缺失)、12號染色體(12三體)、17號染色體(p53基因缺失)及11號染色體(ATM基因缺失)的異常較為常見[1]。本研究通過分析本院93例初診CLL患者的臨床特征與遺傳學異常之間的關系,探討FISH檢測在CLL診斷和治療中的作用及臨床意義。


            1、材料和方法


            1.入組病例

            聯勤保障部隊第九四○醫院血液科2014年5月至2018年12月期間收治的初診慢性淋巴細胞白血病患者93例。所有患者均行骨髓穿刺、流式細胞術等檢查,同時行熒光原位雜交技術檢測,以中國慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤的診斷與治療指南(2015年版)[2]作為診斷和分型依據,其中男67例,女26例,中位年齡61(32-87)歲。

            2.常規染色體核型分析

            染色體標本取自患者骨髓細胞,經RPMI1640培養液24h短期培養后收獲細胞,制備染色體標本并采用G顯帶技術進行核型分析,核型異常命名根據《人類細胞遺傳學國際命名體制(ISCN2013)》進行。每例患者盡可能分析中期分裂細胞20個,每例標本的核型至少經2位醫師共同鑒定。

            3.FISH檢測及信號分析

            組合探針RB1(13q14.1)、D13S25(13q14.3)、p53(17p13.1)、ATM(11q22.3)以及CSP12均購自廣州安必平醫藥科技股份有限公司,應用上述探針檢測13q-、17p-、11q-和12號染色體三體(+12)的異常情況。按照試劑盒提供的FISH操作說明書進行樣本處理、變性,加入配制的探針,放入ThermoBriteTM原位雜交儀(美國自然基因有限公司)中,72℃變性5min,37℃雜交16h,然后洗脫、染色,在熒光顯微鏡下(日本Olympus公司BX51型)通過DAPI/PI/FITC三色濾光鏡觀察雜交信號。每份樣本計數至少200個細胞,并記錄雜交信號及統計各信號的百分率。以20例具有正常核型和非血液系統惡性疾病的患者作為正常對照,記錄各種信號模式占總數的百分率,以百分率的平均值+3SD為陽性判別的閾值。探針閾值分別為RB1(6.5%)、D13S25(6.5%)、p53(6.0%)、ATM(6.0%)及CSP12(7.5%),以異常細胞大于上述閾值作為陽性標準。

            4.臨床資料回顧性分析

            對93例初診CLL患者的臨床資料進行回顧性分析,包括CLL患者的臨床Rai和Binet分期及相關實驗室檢查,以及患者年齡、性別、初診時外周血淋巴細胞絕對值計數、CD38和IGHV突變狀態。采用流式細胞術檢測CD38表達,以≥30%判斷為高表達;IGHV突變狀態采用多重PCR檢測,以免疫球蛋白重鏈(IgH)序列同源性<98%定義為體細胞突變。

            5.統計學分析

            應用SPSS18.0軟件對數據進行統計分析,計數資料使用頻數及百分比描述,分類資料比較使用Pearsonχ2檢驗,P<0.05為差異有統計學意義。


            2、結果


            1.染色體核型分析結果

            93例CLL骨髓樣本中,未見中期分裂相14例(15.1%,14/93),正常核型43例(46.2%),36例(38.7%)檢出染色體異常克隆,其中涉及+12或12號多倍體的共計17例(18.3%);del(13q)/-13的12例(12.9%);del(17p13)/-17的8例(8.6%);del(11q22)/-11的6例(6.5%)。有9例復雜染色體異常與本研究FISH檢測所覆蓋的區域不相關。通過χ2檢驗對2種檢測方法所得數據進行比較。結果證實,FISH檢測陽性率非常顯著高于CC檢測結果(χ2=32.127,P<0.01)(表1)。

            2.FISH檢測細胞遺傳學異常的結果

            93例CLL患者中,存在1種及1種以上分子遺傳學異常的有74例,異常檢出率為79.6%。檢出del(13q)42例(45.2%),其中單純RB1基因(13q14)缺失占7.2%(3/42),單純D13S25基因(13q14.3)缺失占57.1%(24/42),以上二者共同缺失占35.7%(15/42)。單等位基因患者的中位年齡是57(45-79)歲,雙等位基因患者的中位年齡是68(46-80)歲,說明雙等位基因缺失是晚期事件,第二個等位基因的缺失發生在疾病的晚期。93例患者中12號染色體三體(+12)25例(26.9%),中位年齡是66(50-77)歲;17p-患者18例(19.4%),中位年齡是65(50-80)歲;11q-者16例(17.2%),中位年齡是66(42-87)歲。同時伴有2種及2種以上染色體異常患者27例(29.0%),其中,13q-伴17p-者占29.6%(8/27),中位年齡為65(58-80)歲;13q-伴11p-者占18.5%(5/27),中位年齡是60(45-75)歲;13q-伴+12者占14.8%(4/27),中位年齡是68(62-75)歲;同時伴有2種以上染色體異常者占14.8%(4/27),中位年齡是69(52-77)歲(表2)。

            細胞遺傳學異常與其他臨床指標相關性的分析結果

            比較FISH檢測出的細胞遺傳學異常與患者的一般特征和預后指標(臨床分期、外周血淋巴細胞絕對值計數、CD38和IGHV)的相關性。結果發現,各分子遺傳學異常與患者年齡、Rai分期、外周血淋巴細胞計數絕對值和CD38表達水平之間無顯著相關性(P>0.05);女性患者13q-陽性率(65.4%)顯著高于男性患者(37.3%),差異具有統計學意義(P=0.020);FISH檢測結果與Binet分期具有相關性,伴17p-的CLL患者Binet分期更晚(P=0.012);17p-患者IGHV未突變狀態(U-IGHV)的比例顯著高于17p-陰性患者(P=0.013)(表3)。

            3.CD38表達分析結果

            93例CLL患者中,27例患者CD38表達陽性(29.0%)。CD38+的患者中,BinetA期患者7例(25.9%),B期患者7例(25.9%),C期患者13例(48.1%);而在CD38-患者中3期患者比例分別為48.5%、30.3%和21.2%。由此可以看出,CD38+患者中Binet中高危患者(BinetB-C期)比例更高(P=0.027)。CD38+的患者中,51.9%的患者為U-IGHV狀態,顯著高于CD38-患者U-IGHV的比例(22.7%),可見CD38陽性表達與U-IGHV狀態呈顯著相關(P=0.006)(表4)。


            3、討論


            CLL是一種低度惡性的淋巴細胞增殖性疾病,在西方國家約占白血病患者總數的30%,在我國約為3.4%[3]。細胞遺傳學異常往往都與CLL患者的治療及預后密切相關,是CLL危險度分層的重要因素[4]。由于CLL細胞大多處于間期,其增殖能力低下,通常常規細胞遺傳學分析顯示為正常核型;而FISH技術可以同時檢測間期細胞和中期細胞的染色體異常,具有較高的敏感性,能夠快速準確地檢測出常規核型分析不能辨別的DNA小片段(1-103kb)改變[5]。因此,FISH技術的應用可以大大地提高CLL患者細胞遺傳學異常的檢出率。

            本研究采用組合探針FISH和常規染色體核型分析(CC)2種方法,檢測了93例初診CLL患者骨髓細胞染色體異常情況。FISH檢測陽性檢出率顯著高于染色體核型分析檢測的結果(79.6%vs38.7%)(P<0.01)。這表明FISH檢測的檢出率要優于CC技術,與文獻報道[6,7]相符。但FISH探針的選擇具有局限性,所以染色體核型分析仍舊不能被FISH技術所取代,對于初診CLL患者應同時進行FISH及CC檢測,以期發現更多的細胞遺傳學異常。

            在本研究中,涉及13q-的D13S25和RB1基因缺失占45.2%,是CLL染色體異常中發生頻率最高的事件,這與國外的報道[8]一致。有研究認為,D13S325和RB1探針在檢測13q14缺失上無差異,2者同時存在提示較大片段缺失[9],本研究中D13S325基因缺失的陽性率高于RB1基因(25.8%vs3.2%),以上2者共同缺失占16.1%。這說明,13q-既可以是小片段缺失,也可以涉及較大片段缺失。同時,女性患者13q-陽性率顯著高于男性患者(P=0.020)。研究表明,性別差異具有一定預后價值,如女性患者治療后的總體反應率更高,且OS時間較男性患者顯著延長[10]。93例CLL患者中伴17p-的患者18例(19.4%),較國外報道的5%-10%比例[11]更高。伴17p-的患者在診斷時Binet分期更晚(P=0.012),IGHV未突變狀態(U-IGHV)的比例顯著高于17p-陰性患者(P=0.013)。這說明,該部分患者病情進展更快,侵襲性更高,p53基因缺失(17p-)或者突變會嚴重干擾細胞的分化和凋亡,導致腫瘤細胞持續增長且腫瘤容易轉移,并對化療藥物不敏感,這也正是p53基因缺失或突變的患者預后差的原因之一[12]。+12發生在26.9%的患者中,與高增殖活性及中等預后相關,中位總生存期為114個月[13]。ATM基因位于11號染色體的長臂2區2帶(11q22.3)上,是一種DNA損傷反應基因,其表現為對輻射的高度敏感和腫瘤易發傾向,并與激活腫瘤抑制基因p53有關[14]。本研究的16例11q-陽性的患者中,Bient分期為B-C期的患者為12例,說明伴11q-的患者病程呈高度侵襲性,疾病進展迅速。

            研究表明,IGHV未突變(U-IGHV)的患者較IGHV突變(M-IGHV)的患者疾病病程進展更快、生存期更短[15],因為CLL逃避IGHV可獲得抗原持續刺激以促進腫瘤克隆增殖。本研究發現IGHV在不同預后染色體中的分布有差異,17p-陽性患者U-IGHV的比例顯著高于17p-陰性患者(P=0.013),這也從側面證實了影響CLL患者預后的細胞遺傳學異常中,伴17p-患者預后最差[16,17]。CD38是一種與淋巴細胞活化、分化發育等生物學進程密切相關的Ⅱ類跨膜糖蛋白,約33%-42%的CLL患者伴CD38表達,是CLL患者獨立的預后指標[18]。本研究中,29.0%的患者表達CD38,比例與國外報道[19]相近,且與IGHV未突變狀態及臨床分期均呈顯著相關(P值分別為0.027及0.006)。

            綜上所述,應用FISH技術能夠大大地提高CLL患者細胞遺傳學異常的檢出率,是CC技術的有力補充,并且各細胞遺傳學異常與多種臨床指標相關,采用FISH結合臨床指標進行綜合判斷,可能對于評價患者病情和輔助臨床分期有重要作用。由于條件有限,本研究無法準確對細胞遺傳學異常的CLL患者進行預后評估,今后需對這些患者進行長期隨訪,觀察疾病進展及治療情況,為CLL患者的診斷、個體化治療及預后評估提供可靠依據。


            參考文獻:

            [2]中華醫學會血液學分會、中國抗癌協會血液腫瘤專業委員會.中國慢性淋巴細胞白血病/小淋巴細胞淋巴瘤的診斷與治療指南(2015年版).中華血液學雜志,2015,36(10):809-813.

            [7]荊源,林樉,王芳婷,等.熒光原位雜交技術檢測43例慢性淋巴細胞白血病患者基因異常.中國實驗血液學雜志,2018,26(4):1038-1043.


            張海英,楊艷麗,趙強,張京,白海.熒光原位雜交技術檢測慢性淋巴細胞白血病分子遺傳學異常[J].中國實驗血液學雜志,2020,28(05):1474-1479.

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